Histopatologisk undersøgelse af organer og kadavere er et klassisk bredt redskab i diagnostisk arbejde til karakterisering, vurdering og konfirmering af sygdom. Specielt er histopatologi et nødvendigt redskab til udredning af sygelige tilstande med uvis ætiologisk årsag samt f.eks. mistanker om forgiftning. Det formalinfikserede, paraffin indstøbte væv kan også anvendes til agens påvisning ved immunhistokemi og FISH.
Immunhistokemisk undersøgelse har længe været brugt som diagnostisk redskab til påvisning af agens i vævssnit og bygger på princippet, at antistoffer genkender og bindes til specifikke antigener. Ved hjælp af andre reagenser kan antistof-antigen reaktionen visualiseres og aflæses i mikroskop. Diagnostisk kan svaret være påvist/ikke påvist, eller der kan benyttes en semikvantitativ score for tilstedeværelsen af agens i vævssnittet. På Veterinærinstituttet bliver immunhistokemi blandt andet brugt til undersøgelse for Lawsonia intracellularis, Porcint Circovirus type 2 (PCV2) og Equint Herpes virus (EHV-1 - virusabort).
FISH
DTU Veterinærinstituttet har igennem de seneste 10 år i stigende omfang benyttet genteknologiske
metoder til påvisning af infektiøse agens. En af disse metoder er fluorescens in situ hybridisering (FISH) med prober rettet mod bakteriernes ribosomale RNA. På DTU Veterinærinstituttet bliver FISH fortrinsvis benyttet til identifikation af bakterier. Metoden har den fordel, at den er uafhængig af dyrkning af bakterien i laboratoriet og bakterierne kan detekteres som enkelt celler eller mikrokolonier ved mikroskopi.
FISH bygger på hybridisering, hvor man udnytter at enkelt-strengede DNA sekvenser kan binde til en tilført sekvens af DNA eller RNA og danne et nyt dobbeltstrenget molekyle, hvis sekvenserne passer sammen, dvs. hvis sekvensen er komplementær. Ved FISH benytter man små stykker enkelt-strengede RNA-prober, der er mærket med et fluorescerende molekyle. RNA proben, der typisk er mellem 17-24 baser lang, er syntetisk fremstillet og designet således, at den binder til en unik sekvens i bakteriens ribosomale RNA (rRNA). rRNA deltager i syntesen af proteiner og er derfor et molekyle, der er tilstede i alle levende organismer.
Forskellige dele af rRNA har udviklet sig med forskellig hastighed gennem tiden. Hovedparten af genet er meget velkonserveret og med meget få sekvensvariationer mellem de forskellige grupper af bakterier. Disse konserverede områder er gode til prober, der er rettet mod overordnede grupper af bakterier. Andre områder af genet er mere variabelt og kan benyttes til prober rettet mod bakterier på artsniveau.
Da der i aktivt voksende celler kan findes mere end 100.000 kopier af rRNA og dermed mere end 100.000 kopier, hvortil en fluorescens-mærket probe kan hybridisere til, er det muligt at få et signal fra enkelt-celler som kan ses i et fluorescens-mikroskop.
DTU Veterinærinstituttet råder over en ”bank” med cirka 200 forskellige prober rettet mod bakterier, der er vigtige i veterinær sammenhæng. Et eksempel på brug af FISH til diagnostik er identifikation af medlemmer af slægten Brachyspira, af hvilke flere species forårsager diarre og tarmsygdomme i svin.
Sammenligning af immunhistokemi versus FISH
Begge analysemetoder har meget høj specificitet. Modsat immunhistokemi, der er baseret på antistoffers genkendelse af antigen og derfor fænotypisk, er FISH en genotypisk metode, der f.eks. ikke tillader differentiering mellem serotyper. Til gengæld er FISH testudviklingsmæssigt en relativ billig og hurtig løsning modsat immunhistokemi, som testudviklingsmæssigt både er relativt dyr og langvarig, hvis man selv skal lave antistofferne.
Da visualiseringen ved FISH er afhængigt af, at antallet af ribosomer i bakterien er højt, vil forhold som nedsætter cellens fysiologiske aktivitet og dermed mængden af ribosomer nedsætte testens sensitivitet. En af de faktorer som i nogen tilfælde har betydning for sensitiviteten af FISH er hvor lang tid, der går inden prøven bliver fikseret i formalin. Forsøg på DTU Veterinærinstituttet har vist, at efter 4 dage ved stuetemperatur inden formalin-fiksering begynder sensitiviteten af FISH at falde i forhold immunhistokemi. Da der for begge metoder foretages en påvisning af agens in situ, er de lige velegnede til vurdering af infektionspresset af endemisk forekommende sygdomme.
Prøvemateriale
Vævsmateriale fikseret i 10% formalin (4% formaldehyd). Undgå for store og massive stykker da fikseringstiden forlænges. Stykker a 2x2x2 cm er i reglen optimalt.
Specielt hvad angår undersøgelse af tarmvæv, skal det pointeres, at for optimalt udbytte af undersøgelserne bør materialet formalin-fikseres snarest efter udtagning/aflivning af dyret, - blandt andet for at undgå indvækst af forureningsbakterier. Når den formalin-fikserede prøve er indstøbt i paraffin, kan vævet anvendes til både histologi og begge in situ påvisningsmetoder efter relevans.
Kontaktperson: Seniorforsker Tim Kåre Jensen